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产品编号：13805（200种分析） | 保持冷藏室避免暴露在光线下 | 酶标仪 |
产品简介
葡萄糖-6-磷酸（G6P）是葡萄糖转运到细胞中的关键中间体。 G6P也可以转化为糖原或淀粉，用于储存在肝脏和肌肉中。 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）利用G6P产生NADPH形式的还原当量。 这在G6PDH缺乏导致溶血性贫血的红细胞中尤为重要。 AAT Bioquest的Amplite?比色葡萄糖-6-磷酸盐检测试剂盒提供了一种简单，灵敏，快速的方法，用于检测生物样品中的G6P，如血清，血浆，尿液以及细胞培养样品。 在偶联酶测定中，G6P浓度与NADPH成比例相关，NADPH由生色NADPH传感器特异性监测。 吸收微板读数器可以在A575nm / A605nm的吸光度比下读取吸收信号。 使用Amplite?G6P检测试剂盒，我们能够在100μL反应体积中检测到1μM的G6P。
试剂盒套件
96孔板实验方案
简要概述
1.准备G6P分析混合物（50μL）?
2.添加G6P标准品或测试样品（50μL）?
3.在室温下培养30分钟~2小时?
4.监测吸光度比率在A575nm / A605nm处增加
注意：在开始实验之前，在室温下解冻试剂盒组分。
操作步骤
1.制备NADP原液（100X）：
将100μLH2O加入到NADP（组分C）的小瓶中以制备100X NADP原液。
2.准备G6P原液：
将100μLH2O或1xPBS缓冲液加入到G6P标准品（组分D）的小瓶中以制备100mM G6P原液。
注意：未使用的G6P原液应分成单次使用的等分试样并储存在冰箱中。
3.准备G6P标准品的连续稀释液（0至100μM）：
3.1将10μLG6P原液（来自步骤2）加入990μL1xPBS缓冲液中以产生1mM G6P标准溶液。然后将10μL的1mM G6P原液加入990μL1xPBS缓冲液中以产生100μMG6P标准溶液。注意：稀释的G6P标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL的1 mM G6P标准溶液进行1：3连续稀释，得到30,10,3,1,0.3,0.1和0μM的G6P标准品稀释液。
3.3如表1和2中所述，将G6P标准品和含有G6P的测试样品的系列稀释液加入白色透明底96孔微量培养板中。
表1：白色透明底96孔微孔板中G6P标准品和测试样品的分布
注意：G6P = G6P标准，BL =空白对照，TS =测试样品
表2：每个孔的试剂组成
注意：将连续稀释的G6P标准品（0.1μM至100μM）加入G6P1至G6P7的孔中，一式两份。
4. 准备G6P分析混合物：
4.1将5 mL测定缓冲液（组分B）加入一瓶酶混合物（组分A）中。
4.2将50μLNAP原液（100X，步骤1）加入组分A瓶（步骤4.1）中，充分混合。
注意：这种G6P测定混合物足以用于一个96孔板。 在室温下不稳定，应在2小时内及时使用，避免暴露在光线下。
5. 运行G6P检测：
5.1将50μLG6P测定混合物（来自步骤4.2）加入G6P标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总测定体积为100μL/孔。
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL测定混合物。
5.2在室温下孵育反应30分钟至2小时，避光。
5.3用A575nm / A605nm的吸光度板读数器监测吸光度比的增加。
数据分析
空白孔中的吸光度（仅用稀释缓冲液）用作对照，并从具有G6P反应的那些孔的值中减去。 典型的G6P标准曲线如图1所示。注意：吸光度背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的吸光度值非常重要。
图1.使用SpectraMax Plus（Molecular Devices）酶标仪在96孔白色透明底板中用Amplite TM比色G6P测定试剂盒测量G6P剂量响应。 在孵育1小时后，可以检测到100μL体积中低至1μM的G6P。
参考文献
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5. Aster J, Kumar V, Robbins SL, Abbas AK, Fausto N, Cotran RS (2010). Robbins and Cotran pathologic basis of disease
