注1:整个缀合过程可以在一天内完成。但是，缀合前对PE的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为2mg/ml的抗体溶液。请您在进行PE抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注2: SMCC-PE缀合物非常稳定(在“交换缓冲液”中，在4C下至少可以稳定几个月)。因此，如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10毫克或更多的PE,并将其用于几次抗体实验(在几周内)。SMCC-PE的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

 

一.PE的制备

1.将PE纯化。缀合前的浓度通常为5-10 mg/ml。注意：PE在缀合前作为SAS (硫酸铵钠)沉淀物稳定。如果将PE  以SAS沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。

2.使用3.5毫克R-PE修饰每毫克lgG,包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3.检查PE的纯度和浓度，请测量280、565 和620nm 处的吸光度。(1mg/ml的PE在565nm处的OD为8.2 )。565/620比 率 > 5 0表示已充分去除污染的藻蓝蛋白；565/280 比 率 > 5表示已充分去除所有其他蛋白质。

 

二.PE的活化

1.使用前在无水DMSO中制备10mg/ml的SMCC储备溶液。

2.每毫克 PE加入11 μlSMCC,并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60分钟。

3.将纯化的 PE过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC相对于PE的量，可能会有所好转。

 

三.1gG还原

1.在蒸馏水中制备1MDTT(15.4mg/100 μl) 的新鲜溶液。

2.1gG溶液浓度应为4mg/ml或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES、磷酸盐和TRIS缓冲液(pH 范围为6至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于2mg/ml,则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升IgG溶液加入20μlDTT 原液并搅拌。室温下静置30分钟，无需额外搅拌(以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。

4.将还原的lgG通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分

lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT浓度可能会有所帮助。

 

四.进行缀合

1.每毫克 IgG添加3.2毫克 SMCC-PE。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这些摩尔比 ( 每 IgG约2 个PE) 效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2.60分钟后，必须去掉lgG上未反应的游离巯基。

3.在1.0ml干DMSO中制备10mg NEM的新鲜溶液。

4.每毫克 |gG添加34μg(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20分钟。

 

2.60分钟后，必须去掉lgG上未反应的游离巯基。

3.在1.0ml干DMSO 中制备10mg NEM的新鲜溶液。

4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20分钟。