注：PE和APC的完整操作步骤及标记方案在最后两页，如果不需要看介绍，可直接跳过

藻红蛋白(R-PE及B-PE)

特点 ：

1.从红藻中纯化

2.具有高的发射量子产率

3.荧光团与蛋白质主链共价结合，不被淬灭

4.高水溶性

R-PE 与B-PE 的区别 ：

Wavelength (nm)

Wavelerngn (mm)

R-PE 与B-PE 的对比 ：

1.

特点 ：

1.从蓝藻中纯化

2.具有高的发射量子产率

3.荧光团与蛋白质主链共价结合，不被淬灭

4.高水溶性

APC和C-PC 的区别：

APC 和 C-PC 的对比：

交 联 APC    和 APC     的 对 比 ：

1.APC    结构： 它具有α和β亚基，具有明显的(αβ)3 四级结构。

2.为什么要将APC 进 行 交 联 ? 答 ：交联是为了防止APC 在稀释或暴露于变性盐(如尿素或盐酸胍) 时发生可逆解离，从而保持其结构和功能稳定。

3. 如何进行 APC 交联?答：通过α和β亚基间的特异性交联可以阻止APC的分解。

交联比：>1.0

注：图中的红色线条为没有添加NaClO4, 蓝色线条为添加了NaClO4。

如图及表中信息所示，CL-APC 图中添加NaClO4 及没添加NaClO4, 吸收比没有明显变化。而在未交联的APC

中，添加NaClO4,得到的吸收比有非常大的变化，因为APC中加入了NaClO4 导致了它出现了解离。

2.==

特 点 ：

1.存在于大多数光合作用的甲藻中

2.高水溶性

3.大斯托克斯位移

光 谱 特 性 ：

一 ,PE的制备

1.将PE纯化。缀合前的浓度通常为5-10 mg/ml。注意：PE在缀合前作为SAS( 硫酸铵钠 ) 沉淀物稳定。如果将PE 以SAS沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。

2.使用3.5毫克R-PE修饰每毫克lgG,包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3.检查PE 的纯度和浓度，请测量280、565 和620nm 处的吸光度。(1mg/ml 的PE在565nm 处的OD 为8.2 )。 5 65 /620比率 > 5 0表示已充分去除污染的藻蓝蛋白；565/280 比率 > 5表示已充分去除所有其他蛋白质。

二 .PE的活化

1.使用前在无水DMSO 中制备10 mg/ml 的SMCC 储备溶液。

2.每毫克PE加入11 μlSMCC,并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60分钟。

3.将纯化的PE 过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC 相对于PE 的量，可能会有所好转。

三 .1gG还原

1.在蒸馏水中制备1MDTT(15.4  mg/100 μl) 的新鲜溶液。

2.1gG溶液浓度应为4mg/ml或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES、磷酸盐和TRIS缓冲液(pH 范围为6至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于2mg/ml, 则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

3.用DTT 配制20mMlgG 溶液：每毫升IgG 溶液加入20μlDTT 原液并搅拌。室温下静置30分钟无需额外搅拌(以尽量减少半胱an酸再氧化为胱an酸)。

4.将还原的lgG通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低DTT 浓度可能会有所帮助。

四 .进行缀合

1.每毫克IgG添加3.2毫克SMCC-PE。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60分钟。注意：这些摩尔比 ( 每IgG 约2个PE) 效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2.60分钟后，必须去掉lgG上未反应的游离巯基。

3.在1.0ml干DMSO中制备10mgNEM的新鲜溶液。

4.每毫克|gG 添加34μg(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20 分钟。

2.60分钟后，必须去掉lgG 上未反应的游离巯基。

3.在1.0ml 干DMSO 中制备10mg NEM 的新鲜溶液。

4.每毫克|gG添加 34μg(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20分钟。

注1:整个缀合过程可以在一天内完成。但是，缀合前对APC 的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为2 mg/ml的抗体溶液。请您在进行APC抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注2: SMCC-APC缀合物非常稳定(在“交换缓冲液”中，在4C下至少可以稳定几个月)。因此，如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10毫克或更多的 APC,并将其用于几次抗体实验(在几周内)。SMCC-APC的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

一 .APC的制备

1.将APC纯化。缀合前的浓度通常为5-10 mg/ml。注意：APC在缀合前作为SAS(硫酸铵钠)沉淀物稳定。如果将APC以SAS沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。在用每毫升1升的“透析缓冲液”透析之前，用每毫升1升APC 的PBS进行透析2 次。

2.使用1 .7毫克APC修饰每毫克lgG, 包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3.检查APC的纯度和浓度，请测量280。620和655nm处的吸光度。(1 mg/ml 的APC 在655nm处的OD 为 5 . 9 ) 。 655/620 比 率 > 1 . 4 表明杂质被充分去除；655/280 比 率 > 4 表明所有其他蛋白质均已充分去除

二 .APC的活化

1.使用前在无水DMSO 中制备10mg/ml 的SMCC储备溶液。

2.每毫克APC加6μlSMCC,并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60分钟。

3.将纯化的APC 过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC 相对于APC的量，可能会有所好转。

三.1gG 还原

1.在蒸馏水中制备1M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鲜溶液。

2.1gG溶液浓度应为4mg/ml或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行；MES 、磷酸盐和TRIS 缓冲液 (pH 范围为6至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于 2 mg/ml,则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

3.用DTT 配制20mMlgG 溶液：每毫升IgG 溶液加入20μlDTT 原液并搅拌。室温下静置30分钟，无需额外搅拌(以尽量减少半胱an酸再氧化为胱an酸)。

4.将还原的lgG通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低DTT 浓度可能会有所帮助。

四.进行缀合

1.每毫克IgG 添加1.5毫克SMCC-APC。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60分钟。注意：这些摩尔比( 每1gG 约2个APC)效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2.60分钟后，必须去掉lgG 上未反应的游离巯基。

3.在1.0ml干DMSO中制备10mgNEM的新鲜溶液。

4.每毫克|gG 添加34μg(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20 分钟。

2.60分钟后，必须去掉lgG 上未反应的游离巯基。

3.在1.0ml干DMSO 中制备10mg NEM 的新鲜溶液。

4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl) 。 室温下包裹并旋转20分钟。