线粒体膜电位荧光探针的信号淬灭现象是影响其检测准确性的重要因素,相关研究涉及淬灭原因、影响因素等多个方面,具体如下:
一、淬灭原因:
浓度依赖:部分探针存在浓度依赖性荧光淬灭。如线粒体膜电位荧光探针JC-1在高浓度下,分子间相互作用增强,会发生自淬灭,即使线粒体膜电位稳定,也可能出现红色聚集态荧光假性降低,导致误判。
聚集诱导:像罗丹明123这样的探针,具有聚集诱导淬灭特性。在正常线粒体膜电位下,其会在线粒体内聚集,从而导致荧光淬灭,荧光强度降低。
光漂白:激光等强光照射会使探针发生光氧化或结构破坏,导致荧光淬灭,例如 DiSC3 (5) 探针,在激光照射下易发生光漂白,影响信号稳定性。
二、影响因素:
探针自身特性:不同探针的化学结构和光学性质不同,淬灭特性也有差异。一些探针的激发/发射光谱若与细胞内源性荧光物质重叠,会导致背景信号升高,间接影响对真实膜电位变化信号的检测,使检测结果出现偏差。
细胞状态:细胞发生凋亡或坏死时,线粒体膜电位丢失,线粒体通透性转换孔持续开放,探针会从线粒体中释放出来,导致荧光强度降低,这种情况易与信号淬灭现象混淆。另外,若细胞内存在大量可与探针结合的物质,可能会改变探针的分布和浓度,促使淬灭发生。
实验环境:光照是导致荧光淬灭的重要环境因素,荧光染料通常需要避光保存和使用,以减缓荧光淬灭。此外,温度、pH值等环境因素也可能影响探针的稳定性,过高或过低的温度、不适宜的pH值都可能使探针结构发生变化,进而引发信号淬灭。
应对策略:针对信号淬灭现象,可选择具有抗淬灭特性的探针,如具有聚集诱导发光(AIE)特性的线粒体膜电位探针,其与传统探针相反,在聚集状态下荧光显著增强,且抗光漂白能力强,适合长时间动态追踪线粒体膜电位变化。同时,在实验操作中,应严格控制探针使用浓度,避免过高浓度导致自淬灭,并注意避光操作,必要时可添加抗淬灭剂,以减少信号淬灭对检测结果的影响。
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