线粒体膜电位（ΔΨm）是线粒体功能的核心指标，其稳定与否直接关联细胞能量代谢、氧化应激平衡及凋亡进程。在中暑病理机制中，高温应激会引发细胞内氧化应激过载、钙稳态失衡及炎症因子爆发，进而导致线粒体功能损伤，ΔΨm下降是线粒体功能紊乱的早期标志性事件，因此，利用线粒体膜电位荧光探针精准监测中暑细胞模型中的ΔΨm变化，对解析中暑的细胞损伤机制、筛选潜在干预药物具有重要意义。
一、常用线粒体膜电位荧光探针的选择与特性
用于中暑细胞模型ΔΨm监测的线粒体膜电位荧光探针需满足高线粒体靶向性、对ΔΨm变化敏感及低细胞毒性的核心要求，目前主流探针可分为阳离子型亲脂类探针和比率型探针两类：
阳离子型亲脂类探针：以JC-1、Rh123（罗丹明123）为代表，其作用机制依赖线粒体膜电位的 “电位驱动富集” 特性 —— 在正常ΔΨm下，探针因带正电荷可跨膜进入线粒体基质并富集，呈现特定荧光信号；当ΔΨm下降时，探针从线粒体释放至胞质，荧光信号发生显著改变。其中，JC-1因“聚合态-单体态”的荧光转换特性成为首选：正常ΔΨm下，JC-1 在基质中聚合形成红色荧光（发射波长～590nm）；ΔΨm降低时，聚合态解离为单体，荧光转为绿色（发射波长～525 nm），通过红/绿荧光强度比值可直观反映ΔΨm变化，有效避免细胞密度、探针装载量差异带来的干扰，更适合中暑细胞模型中动态、定量分析。Rh123则为单波长探针，正常状态下在 mitochondria 内发出强绿色荧光，ΔΨm下降时荧光强度减弱，虽操作简便，但易受细胞形态、仪器参数波动影响，更适用于定性或半定量分析。
比率型探针：如 TMRM（四甲基罗丹明甲酯）和 TMRE（四甲基罗丹明乙酯），虽非 “聚合 - 单体” 转换机制，但可通过 “低浓度装载 - 荧光强度比率” 实现 ΔΨm 定量：在低浓度下，探针特异性富集于线粒体，其荧光强度与 ΔΨm 呈正相关，且可通过活细胞实时成像观察 ΔΨm 的动态变化，尤其适合监测中暑过程中 ΔΨm 的快速波动（如高温应激后 0.5-2 h 内的瞬时变化）。不过，TMRM/TMRE需严格控制装载浓度，高浓度可能导致线粒体膜电位去极化干扰，因此在中暑细胞模型中需提前优化浓度（通常为20-50nM），平衡荧光信号与细胞毒性。
二、中暑细胞模型的构建与探针监测流程
（一）中暑细胞模型的构建原则
需模拟体内中暑的“高温应激+代谢紊乱”特征，常用细胞类型包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）及神经细胞（如SH-SY5Y）—— 内皮细胞可反映中暑时血管内皮损伤，神经细胞则对应中暑引发的中枢神经系统损伤。模型构建通常采用“持续高温孵育”法：将对数生长期细胞置于39-42℃恒温培养箱（模拟核心体温升高），孵育2-6h，同时可结合高湿度、5% CO?环境维持细胞存活，通过检测细胞存活率（CCK-8法）、乳酸脱氢酶（LDH）释放量（反映细胞膜损伤）及活性氧（ROS）水平（DCFH-DA 探针）验证模型有效性，确保ΔΨm变化是高温应激而非细胞大量死亡导致的非特异性结果。
（二）探针监测的关键流程与优化
探针装载前处理：中暑应激处理后的细胞需先置于37℃、5% CO?环境恢复10-15min（避免高温直接影响探针与线粒体的结合效率），随后用无血清培养基洗涤2次，去除细胞外残留的代谢废物及炎症因子，减少对探针信号的干扰。
探针孵育条件优化：以线粒体膜电位荧光探针JC-1为例，通常将探针用无血清培养基稀释至终浓度5-10μM，加入细胞培养板后在37℃孵育20-30min，期间需避光（防止探针光漂白）；孵育结束后用预热至37℃的PBS快速洗涤3次，避免残留的胞质游离探针影响荧光比值。对于Rh123，孵育浓度可降至1-5μM，孵育时间缩短至15-20min，因过量Rh123可能导致线粒体“质子泄漏”，反而加剧ΔΨm下降，需通过预实验确定适宜的浓度。
荧光检测方式选择：根据研究需求可采用流式细胞术或激光共聚焦显微镜：
流式细胞术可实现大量细胞的ΔΨm定量分析，通过检测 JC-1的红/绿荧光比值，计算ΔΨm下降细胞的百分比（如中暑应激4h后，ΔΨm下降细胞占比可从正常组的5%升至40%以上），适合统计分析不同处理组（如高温组、高温+抗氧化剂干预组）的差异；
激光共聚焦显微镜则可实时观察单个细胞内线粒体的形态变化与 ΔΨm 分布，清晰捕捉中暑过程中 “线粒体碎片化”与“ΔΨm 局部下降”的关联 —— 正常细胞中，JC-1 红色荧光呈网状分布（线粒体完整），而中暑应激后，红色荧光减弱、绿色荧光增强，且荧光信号呈点状分散（线粒体断裂），直观呈现线粒体功能损伤的空间特征。
三、监测结果的解读与应用价值
（一）ΔΨm变化与中暑细胞损伤的关联
中暑细胞模型中，ΔΨm的变化具有时间依赖性和剂量依赖性：高温应激初期（0.5-1h），ΔΨm 先出现短暂升高（可能是线粒体代偿性产热引发的电位波动），随后随应激时间延长（2-6h）逐渐下降，且下降幅度与高温强度正相关（42℃组ΔΨm下降速率显著快于39℃组）。当ΔΨm下降超过30%时，通常伴随细胞色素c从线粒体释放至胞质，启动 caspase 凋亡通路，此时细胞存活率开始显著下降，提示ΔΨm下降是中暑细胞从“功能紊乱”向“不可逆凋亡”转化的关键节点。此外，若在高温应激同时加入线粒体保护剂（如辅酶Q10、线粒体靶向抗氧化肽MitoQ），可显著延缓 ΔΨm 下降，进一步验证ΔΨm损伤在中暑细胞病理中的核心作用。
（二）应用价值
机制研究：通过监测ΔΨm变化，可明确中暑时线粒体损伤的关键调控因子 —— 例如，研究发现中暑时ROS过量产生会抑制线粒体呼吸链复合体I活性，导致ΔΨm生成障碍，而敲除ROS相关基因（如NOX4）可缓解ΔΨm下降，这一过程可通过线粒体膜电位荧光探针JC-1 荧光比值的动态变化直观验证。
药物筛选：将ΔΨm变化作为筛选指标，可快速评估潜在抗中暑药物的有效性 —— 例如，从天然产物中筛选出的迷迭香酸，可通过激活线粒体自噬（mitophagy）清除损伤线粒体，维持 ΔΨm 稳定，其效果可通过激光共聚焦观察到“红色荧光信号恢复”及流式细胞术“红/绿比值升高” 来确认。
诊断标志物探索：虽然目前ΔΨm监测主要用于细胞模型，但通过分析中暑患者外周血单个核细胞（PBMC）的ΔΨm变化，发现其与患者体温、器官损伤程度呈负相关，未来有望通过优化探针（如开发可穿透细胞膜的活体探针），将ΔΨm监测拓展至中暑的临床早期诊断。
四、监测过程中的注意事项
避免探针干扰：部分阳离子型探针（如JC-1）在高浓度时可能与细胞膜非特异性结合，或诱导线粒体通透性转换孔（mPTP）开放，导致假阳性ΔΨm下降，因此需通过预实验确定“有效检测浓度下限”（即能观察到清晰线粒体荧光且不影响细胞活力的浓度）。
控制实验条件一致性：孵育温度、CO?浓度、洗涤速度等均会影响探针装载效率，例如洗涤过快可能导致线粒体富集的探针流失，过慢则增加胞质残留，因此需严格统一操作流程，每组实验设置正常温度对照组（37℃）和ΔΨm阳性对照（如加入mPTP开放剂苍术苷A）。
活细胞监测时长：线粒体膜电位荧光探针在细胞内的稳定性有限（如JC-1在活细胞内的有效信号持续时间约1-2h），若需长时间监测（如6h动态观察），建议采用 “间歇式装载” 或选择稳定性更高的探针（如TMRM），避免因探针降解导致的信号失真。
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