使用线粒体膜电位荧光探针时，探针的荧光信号变化与线粒体膜电位（ΔΨm）的高低直接相关，这种关联是其用于监测线粒体功能状态的核心原理。
正常生理状态下，线粒体通过呼吸链持续产生质子梯度，使内膜内侧（基质侧）呈负电位，外侧呈正电位，形成稳定的膜电位（通常为-150~-180 mV），具有亲脂性阳离子特性的线粒体膜电位荧光探针（如JC-1、TMRM、DiOC6等）会因静电作用被吸引并富集于线粒体内。此时，探针在高膜电位环境中聚集或维持特定构象，荧光信号呈现稳定的高强度（如JC-1在高电位下形成红色荧光的聚集体）。
当线粒体功能受损（如氧化应激、缺血缺氧、毒素作用等），呼吸链功能障碍会导致质子梯度无法维持，膜电位下降（去极化）。此时，线粒体膜电位荧光探针的富集能力减弱，线粒体内的探针浓度降低：对于JC-1这类探针，低电位下会解离为绿色荧光的单体，荧光颜色从红转绿，可通过红绿荧光比值定量反映电位变化；对于TMRM等单波长探针，荧光强度会随膜电位下降而减弱，直接指示电位降低。
此外，在细胞凋亡早期，线粒体膜电位的下降是标志性事件，探针荧光信号的减弱或变色可作为凋亡启动的早期指标。而在某些生理过程（如线粒体融合/分裂）中，膜电位的局部波动也可通过探针的荧光变化被实时捕捉，从而实现对线粒体动态功能的可视化监测。
这种荧光信号与膜电位的紧密关联，使得探针能特异性地将抽象的电位变化转化为直观的光学信号，成为研究线粒体功能的重要工具。
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