线粒体活性氧荧光探针与CRISPR/Cas9基因编辑结合策略，主要是通过CRISPR/Cas9技术对线粒体相关基因进行编辑，然后利用线粒体活性氧荧光探针来检测线粒体活性氧的变化，从而研究基因编辑对线粒体功能和活性氧水平的影响。以下是具体的结合策略：
构建线粒体靶向的CRISPR/Cas9系统：为了使CRISPR/Cas9系统能够特异性地作用于线粒体，可以对其进行线粒体靶向修饰。如在Cas9蛋白的N端融合线粒体定位信号（MTS），形成具有线粒体选择性的mito-Cas9。同时，设计特异性靶向线粒体基因的crRNA，如靶向线粒体端粒酶逆转录酶（TERT）基因的crRNA，将mito-Cas9、crRNA、RNA同源重组修复模板以及线粒体 TERT 基因双链同源模板等组装成线粒体靶向的基因编辑复合体（LCCT），该复合体可通过线粒体靶向剂三苯基膦等修饰的阳离子脂质体包裹，实现对线粒体基因组的编辑。
选择合适的线粒体活性氧荧光探针：根据实验需求选择合适的荧光探针，如MitoSOX Red，它是一种广泛用于检测活细胞线粒体中超氧化物的荧光探针，其分子中带正电荷的三苯基膦（TPP?）基团能使其特异性地靶向至线粒体基质中，并可被线粒体内部产生的超氧化物特异性氧化，氧化后的产物能与线粒体或细胞核内的DNA结合，产生强烈的红色荧光，荧光强度与线粒体中超氧化物的水平成正比，可通过测量荧光强度来定量超氧化物的生成量。
结合策略的实施步骤：首先，将构建好的线粒体靶向的CRISPR/Cas9系统导入细胞，使其对线粒体基因进行编辑，例如上调线粒体TERT基因的表达。然后，加入线粒体活性氧荧光探针，如 MitoSOX Red，孵育一段时间后，通过荧光显微镜、流式细胞术或荧光酶标仪等设备检测荧光信号。通过比较基因编辑前后荧光信号的变化，来评估基因编辑对线粒体活性氧水平的影响。此外，还可以设置对照组，如未进行基因编辑的细胞组、使用超氧化物歧化酶类似物清除超氧化物的阴性对照组等，以确保实验结果的准确性。
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