实验方案

储备溶液配制

在高质量无水DMSO制备2至5 mM 的Fluo-3 AM中储备溶液。

工作溶液配制

Fluo-3 AM工作溶液
1.在实验当天，将Fluo-3AM溶解在DMSO中，或将指示剂储备溶液的等分试样解冻至室温。

2.在含有0.04%Pluronic®F-127的缓冲液（例如Hanks和Hepes缓冲液）中制备2至20μM Fluo-3 AM工作溶液。对于大多数细胞系，建议使用最终浓度为4-5μM的Fluo-3 AM。细胞负载所需指示剂的确切浓度请根据经验确定。

注：非离子洗涤剂Pluronic F-127用于提高Fluo-3 AM的水溶性。可从百萤购买各种Pluronic F-127溶液。
注：如果你的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以将丙磺舒（1-2mM）添加到染料工作溶液中（最终井内浓度为0.5-1mM），以减少酯化指示剂的泄漏。多种形式的丙磺舒产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，可从百萤购买。

操作步骤

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。本方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

1.在生长培养基中培养细胞过夜。
2. 天，将1X Fluo-3 AM工作溶液添加到孔板中。
注意：如果你的化合物干扰血清，在染色前用新鲜的HHBS缓冲液代替生长培养基。
3.将加入染料的孔板在37°C的细胞培养箱中培养30至60分钟。
注：将染料培养2小时以上可以提高某些细胞系的信号强度。
4.用HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1mM丙磺舒）代替染料工作溶液，以去除任何多余的探针。
5.根据需要添加刺激物，并同时使用配备有FITC滤波片组的荧光显微镜或包含可编程液体处理系统（如FDSS、FLIPR或FlexStation）的荧光酶标仪在490/525nm，Cutoff=515nm处检测荧光强度。

图示

将U2OS细胞以40,000个细胞/100μL/孔接种过夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。 除去生长培养基，将细胞分别与100μLFluo-3 AM，Fluo-4 AM和Fluo-8 AM在HHBS中以4μM浓度在37℃，5％CO 2中温育。 孵化器1小时。 用200μLHHBS洗涤细胞两次，然后使用FITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。

试剂应用文献

AMPA receptors in the synapse turnover by monomer diffusion
Authors: Morise, Jyoji and Suzuki, Kenichi GN and Kitagawa, Ayaka and Wakazono, Yoshihiko and Takamiya, Kogo and Tsunoyama, Taka A and Nemoto, Yuri L and Takematsu, Hiromu and Kusumi, Akihiro and Oka, Shogo
Journal: Nature communications (2019): 1--18

Cryo-EM Studies of TMEM16F Calcium-Activated Ion Channel Suggest Features Important for Lipid Scrambling
Authors: Feng, Shengjie and Dang, Shangyu and Han, Tina Wei and Ye, Wenlei and Jin, Peng and Cheng, Tong and Li, Junrui and Jan, Yuh Nung and Jan, Lily Yeh and Cheng, Yifan
Journal: Cell Reports (2019): 567--579