Sanger法是DNA测序中最早*的方法之一，DNA由四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）合成。将每个新核苷酸添加到*的dNTP的3'-OH基团中。可以将二脱氧胸苷三磷酸（ddTTPs）添加到正在生长的DNA链中，但是当它出现时，链延长会停止，因为下一个要连接的核苷酸没有3'-OH。待测序的DNA被制备成单链。该模板DNA带有大量dATP，dGTP，dCTP和dTTP的混合物。加入四种双脱氧核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP和ddTTP）的混合物，每种混合物均以限量存在，并分别用发不同颜色的荧光的“标签”标记。因为所有四个正常核苷酸都存在，所以链延伸正常进行，直到偶然地DNA聚合酶插入ddNTP（而不是正常dNTP）。